Mycoprotein (Fusarium venenatum) related methods/it

▼Gruppo di ricerca Free Appropriate Sustainability Technology (FAST) della Western University

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Questa pagina illustra i metodi che potrebbero essere necessari a chiunque lavori al progetto sulle micoproteine ​​(dai rifiuti al cibo). Descrive aspetti come la preparazione di piastre e terreni di coltura, l'uso dell'autoclave e semplici tecniche di trasferimento microbico. La pagina verrà aggiornata non appena il progetto avrà inizio.

• Visita guidata al laboratorio di sicurezza del Dr. Pearce
• Consapevolezza in materia di salute e sicurezza dei lavoratori
• WHMIS 2015 - Sistema informativo sui materiali pericolosi sul luogo di lavoro
• Sicurezza in laboratorio e gestione dei rifiuti pericolosi
• Formazione sulla biosicurezza

I DPI servono a proteggere TE, così che tu possa continuare a fare ciò che desideri.

1. Occhiali di sicurezza: sempre obbligatori
2. Camice da laboratorio - sempre obbligatorio
3. Guanti - potrebbero essere necessari

Sapere quali sostanze chimiche sono presenti in laboratorio e come interagiscono tra loro è fondamentale in caso di incidenti.

1. Le schede di sicurezza (SDS) pertinenti devono essere consultate online.
2. Presta attenzione ai pericoli elencati sulla porta del laboratorio. Se introduci nuove attrezzature o materiali, devi ottenere l'approvazione della persona responsabile indicata sulla porta del laboratorio. Se le informazioni sulla persona responsabile non sono aggiornate, contatta la direzione del dipartimento per richiederne l'aggiornamento.

Ubicazione: Edificio di Biologia e Scienze Geografiche, Stanza 3071

Importante: ASSICURARSI CHE IL LIQUIDO RIEMPIA IL CONTENITORE IN VETRO SOLO FINO A METÀ!!!

Operazione:

Dopo aver preparato il terreno di coltura in un matraccio/vaso di vetro autoclavabile, coprirlo con un foglio di alluminio. Etichettare il matraccio indicando il contenuto e applicare un piccolo pezzo di nastro adesivo per autoclave sul "coperchio" di alluminio. I vasi possono essere dotati di coperchio; in tal caso, non chiuderlo ermeticamente per evitare che esploda in autoclave. Posizionare il matraccio contenente il terreno di coltura in un vassoio metallico che si trova sul piano di lavoro vicino all'autoclave, riempirlo d'acqua (fino a circa 2,5 cm di profondità) e inserirlo con cautela nell'autoclave. Chiudere l'autoclave e selezionare il ciclo. A seconda del volume di ciascun matraccio/vaso, potrebbe essere necessario un ciclo diverso. In genere, per volumi inferiori a 500 ml, utilizzare il ciclo Liquid30 che dura circa un'ora. Una volta completato il ciclo, aprire l'autoclave e lasciarla aperta per alcuni minuti. FARE UN PASSO INDIETRO PER EVITARE CHE IL VAPORE BOLLENTE USTIONI IL VISO! Indossando guanti resistenti al calore (anch'essi disponibili sul piano di lavoro vicino all'autoclave), estrarre con cautela il vassoio. Rimuovere il terreno di coltura e versare l'acqua nel lavandino. Dopo aver lasciato l'autoclave aperta per alcuni minuti, ricordati di richiuderla. Assicurati di annotare le informazioni sul foglio di registrazione presente sul bancone, segnalando eventuali anomalie o semplicemente apponendo un segno di spunta se tutto è a posto. Il nastro adesivo dell'autoclave sul supporto di coltura dovrebbe ora presentare delle strisce nere, a indicare che il supporto è stato sterilizzato in autoclave.

PER MATERIALI ASCIUTTI (improbabile che ne abbiate bisogno, ma per sicurezza):

Molto simili ai liquidi, tranne per alcune differenze fondamentali:

1. Non aggiungere acqua al vassoio
2. Utilizza il ciclo chiamato gravity (potrebbe essere gravity20, grav o qualcosa di simile... ma non un ciclo per liquidi)

Si prega di notare che le autoclavi possono variare. Assicuratevi sempre di avere la formazione adeguata e/o di essere sotto la supervisione di qualcuno che sappia come utilizzarle. Un uso improprio può essere pericoloso.

Per preparare le piastre di agar al malto per la crescita di ceppi di F. venenatum , misurare la massa appropriata di estratto di malto e agar e aggiungerla ad acqua distillata _. Per 200 ml, misurare 6 g di estratto di malto e 3 g di agar. Aggiungere 100 ml di acqua _distillata in una beuta, mescolare fino a completa dissoluzione e portare il volume a 200 ml con altra acqua distillata. _Coprire con un foglio di alluminio, applicare del nastro adesivo per autoclave e sterilizzare in autoclave. Una volta completata l'autoclavatura, lasciare raffreddare il liquido a circa 50 °C prima di versarlo nelle piastre (solidificherà quando raggiungerà quasi la temperatura ambiente).

In un ambiente di lavoro sterile, disporre le piastre di Petri in modo che i coperchi possano essere sollevati facilmente con una mano e l'agar fuso versato con l'altra. Versare una quantità di liquido sufficiente a coprire quasi completamente la superficie e chiudere con il coperchio. Ruotare le piastre per ricoprire l'intera superficie e lasciarle riposare fino a quando l'agar non si sarà solidificato. A seconda del grado di sterilità dell'ambiente, potrebbe essere utile lasciare il coperchio leggermente aperto per evitare la formazione di condensa. Una volta solidificato, sigillare con parafilm (facoltativo, ma utile per proteggere dalla contaminazione, sebbene non in modo perfetto) e conservare le piastre capovolte. Etichettare ogni piastra con il tipo di terreno di coltura e la data di preparazione (etichettare sul fondo, non sul coperchio). Conservare le piastre a 4 °C o in un luogo fresco.

Per preparare i terreni di coltura liquidi per la crescita di F. venenatum , si utilizzeranno l'estratto di malto e terreni alternativi. La preparazione dei terreni è la stessa, ad eccezione dei componenti da disciogliere (ad esempio, il terreno con estratto di malto conterrà estratto di malto, mentre il terreno alternativo conterrà glucosio, solfato di magnesio, ecc.). Iniziare misurando i componenti e sciogliendoli in 200 ml di H₂O DI _in un barattolo di vetro etichettato. Coprire con un foglio di alluminio e chiudere il coperchio senza stringerlo completamente prima di sterilizzare il terreno in autoclave. Una volta sterilizzato in autoclave, lasciarlo raffreddare e chiudere ermeticamente il coperchio. Conservare fino al momento dell'uso.

In condizioni sterili, aprire la piastra di Petri contenente il micelio di F. venenatum e tagliare un piccolo pezzo di agar. Prelevarlo e posizionarlo capovolto su una nuova piastra di agar al malto. Incubare la piastra appena inoculata a temperatura ambiente. La crescita dovrebbe avvenire in circa 4-5 giorni.

In condizioni sterili, aprire la piastra di Petri contenente il micelio di F. venenatum e tagliare un pezzo di agar con la crescita. Prelevarlo, spezzettarlo in alcuni piccoli pezzi e metterlo in un barattolo contenente 200 ml di terreno di coltura sterile. Chiudere il barattolo con il coperchio e incubare a temperatura ambiente. La crescita dovrebbe richiedere alcuni giorni ed è consigliabile agitare il terreno ogni poche ore (oppure, se disponibile, tenerlo in un incubatore con agitatore a bassa velocità).

Versare semplicemente il contenuto del barattolo da 200 ml di terreno di coltura con F. venenatum nel volume più grande, chiudere il coperchio e incubare a temperatura ambiente. Volumi maggiori probabilmente rallenteranno la crescita. Assicurarsi di agitare il terreno di coltura ogni poche ore se non si utilizza un incubatore con agitatore.

A seconda del volume finale desiderato, potrebbe essere necessario aumentare gradualmente le dimensioni. Alcuni organismi semplicemente non crescono in volumi troppo grandi perché ciò diluisce eccessivamente il substrato, quindi potrebbe essere necessario trasferire 200 ml in 1 litro, poi 1 litro in 5 litri e così via.

L'obiettivo è verificare se il Fusarium venenatum , un fungo utilizzato nella produzione di micoproteine, possa essere coltivato su diversi substrati di coltura derivati ​​da scarti. Gli esperimenti si articoleranno in due parti principali: il mantenimento del ceppo di F. venenatum su piastre di Petri con agar di malto e la coltivazione di F. venenatum su diversi substrati.

Materiali necessari: terreno di coltura agarizzato con estratto di malto preparato in una piastra di Petri e una piastra di Petri contenente la crescita di F. venenatum .

Metodo: vedere la sezione "Trasferimento della crescita di F. venenatum da piastra a piastra" sopra. Una piastra dovrebbe rimanere vitale per alcune settimane se conservata in condizioni igieniche, ma controllare sempre la presenza di contaminazione prima dell'uso. Questo metodo può essere utilizzato anche per verificare la contaminazione del campione utilizzato per la crescita in coltura liquida, poiché ogni volta che una piastra di Petri contenente F. venenatum viene aperta per il trasferimento in terreno liquido, è possibile anche seminare un campione. Ciò contribuirà a mantenere la scorta, ma anche a verificare se sulla piastra cresce qualcosa di inatteso, poiché è possibile che il terreno liquido inoculato in quel momento fosse contaminato.

Materiali necessari: terreno di coltura sterile e preparato e piastra di Petri con F. venenatum .

Metodo: Vedere la sezione "Trasferimento di F. venenatum in terreni liquidi a basso volume" sopra. Questa parte si compone di due fasi: la crescita in un piccolo volume (in un barattolo di vetro) e il successivo trasferimento in un volume maggiore (in un bioreattore). Questo perché iniziare con un volume elevato può rendere difficile la crescita, dato che alcuni organismi non riescono a crescere in condizioni di diluizione molto elevata.

Iniziate con un substrato a base di estratto di malto, poi provate un substrato alternativo. Se entrambi funzionano, potete iniziare a sperimentare con diversi tipi di substrato; cartone cotto in autoclave, rifiuti di plastica e scarti alimentari sono tutti ottimi punti di partenza da considerare.

Ecco alcune informazioni sulla composizione dell'estratto di malto e sui terreni di coltura alternativi:

Sciogliere in acqua distillata e sterilizzare in autoclave. Per i terreni di coltura liquidi, non aggiungere agar.

Potrebbe essere necessario aggiungere anche (NH4)H2PO4 a una concentrazione di 4,5 g/L se disponibile (fonte di azoto). Sciogliere in acqua distillata e sterilizzare in autoclave.

Dopo aver coltivato F. venenatum in quantità relativamente elevate, è necessario processarlo per produrre effettivamente le micoproteine. Questo processo è ancora oggetto di studio, ma probabilmente prevederà la filtrazione del terreno di coltura liquido per separare la biomassa, l'essiccazione della biomassa e il riscaldamento per ridurne il contenuto di RNA, e infine la miscelazione con altri ingredienti (ad esempio, olio vegetale, uova).